1-3 شاخص‌های مربوط به اختلالات چندگانه اسپرم:
اسپرم‌های طبیعی اغلب اختلالات متعددی دارند (در ناحیه سر، ناحیه میانی یا اصلی و یا ترکیبی از آنها). اطلاعات حاصل از ارزیابی این شاخص‌ها مفیدتر از زمانی است که فقط درصد اسپرم‌های نرمال گزارش ‌شود. سه شاخص زیر را می‌توان از آنالیز اسپرم‌ها بدست آورد:
1.    The  multiple  anomalies  index )MAI)
2.    The  teratozoospermia  index (TZI)
3.    The  sperm  deformity  index (SDI)
شاخص‌های MAI و TZI با میزان باروری در بدن و شاخص SDI با میزان باروری در محیط آزمایشگاهی مرتبط می‌باشند و در ارزیابی برخی از شرایط پاتولوژیک مفیدند.

1-1-3 روش محاسبه شاخص‌های مربوط به اختلالات اسپرم:
همانطور که قبلاً هم ذکر شده است اسپرم‌های غیرطبیعی ممکن است دچار اختلال در سر، قطعه میانی یا قطعه اصلی باشند و یا سیتوپلاسم اضافی داشته باشند. MAI میانگین تعداد اختلال در اسپرم‌های غیرطبیعی است. برای محاسبه این شاخص تعداد اختلالات سر، قطعه میانی و اصلی را باید محاسبه کرد. TZI مشابه MAI است با این تفاوت که اختلال سیتوپلاسم اضافی نیز در محاسبه منظور می‌شود. شاخص SDI از تقسیم تعداد اختلالات بر تعداد کل اسپرم‌ها بدست می‌آید.
در جدول )1-3( نحوه محاسبه این شاخص‌ها برای 200 اسپرم آمده است:

آزمایشات متفرقه اسپرم

2-1-3 مثال عملی:
در بررسی 200 اسپرم، 42 مورد طبیعی و 158 مورد غیرطبیعی بوده است. در این میان 140 اسپرم دچار اختلال سر، 102 مورد اختلال در قطعه میانی، 30 مورد اختلال در قطعه اصلی و 44 مورد سیتوپلاسم اضافی داشته‌اند. در بررسی 200 اسپرم دیگر ازهمین نمونه، 36 مورد طبیعی و 164 مورد غیرطبیعی بوده است. در این میان 122 مورد اختلال سر، 108 مورد اختلال در قطعه میانی، 22 اختلال در قطعه اصلی و 36 مورد سیتوپلاسم اضافی داشته‌اند.
TZI  = 1/88
درجدول )2-3( مقدار TZI و MAI در مردان غیرباروری که به پزشک مراجعه کرده‌اند با مردانی که در طی سه سال دارای فرزند شده‌اند مقایسه شده است.
 
2-3 رنگ‌آمیزی ایمونوشیمیایی (CD45) لکوسیت‌ها:
نوتروفیل‌هایی که گرانول‌های خود را آزاد کرده‌اند و سایر لکوسیت‌ها (مثل لنفوسیت‌ها، ماکروفاژها یا مونوسیت‌ها) را نمی‌توان با رنگ‌آمیزی اورتوتولوئیدین شناسایی نمود اما به روش ایمونوشیمیایی می‌توان آنها را تشخیص داد. این رنگ‌آمیزی‌ها گران‌تر و وقت‌گیرتر از رنگ‌آمیزی پراکسیداز هستند اما برای تفکیک لکوسیت‌های فوق از سلول‌های زایا مفیدند.

1-2-3 اصول کار:
 تمام لکوسیت‌های انسان آنتی‌ژنی اختصاصی به نام CD45 دارند که با استفاده از یک آنتی‌بادی مونوکلونال مناسب قابل شناسایی است. البته با استفاده از آنتی‌بادی‌های مونوکلونال دیگر، می‌توان لکوسیت‌های مختلف از قبیل ماکروفاژها، مونوسیت‌ها، نوتروفیل‌ها، لنفوسیت‌های B و T را نیز از یکدیگر تفکیک نمود.

2-2-3 معرف‌ها:
الف- محلول سالین- فسفات- بافر دولبکو (DPBS)
ب- بافر تریس (TBS) با PH=8.2
ج-Tetramisole-HCl (levamisole) با غلظت 1mol/L: مقدار g4/2 لوامیزول را درml10 آب خالص حل کنید.
د- سوبسترا: به ml 7/9 از TBS، 2mg از naphtol AS-MX Phosphate و 0/2ml دی متیل فورمامید و 0/1ml لوامیزول 1mol/L اضافه کنید. قبل از مصرف 10mg از نمک Fast Red TR را اضافه کرده و با کاغذ صافی (0/45 µm) آن را صاف کنید.
ه- فیکساتیو: برای فیکس کردن می‌توان از استن و یا مخلوط استن- متانول- فرمالدئید استفاده کرد (بهml 95 از استن، ml95 متانول مطلق و ml10 فرمالدئید %37  ) اضافه کنید)
و- آنتی‌بادی اول: مونوکلونال آنتی‌بادی تهیه شده از موش بر علیه آنتی‌ژن CD45 لکوسیت‌ها
ز- آنتی‌بادی دوم: آنتی‌بادی ضد ایمونوگلبولین‌های موش که از خرگوش بدست می‌آید.
ح- کمپلکس آلکالن فسفاتاز- آنتی آلکالن فسفاتاز (APAAP)
ط- مخلوط رنگ هماتوکسیلین هریس (به عنوان رنگ زمینه)
3-2-3 روش کار:
1-3-2-3 آماده‌سازی اسپرم:
اسپرم را بخوبی مخلوط کرده و 0/5mL از آن را با 5 حجم DPBS مخلوط کنید و سپس 5 دقیقه در 500g سانتریفوژ نمایید. محلول رویی را دور ریخته و رسوب را مجدداً در 5 حجم DPBS حل کنید. مجدداً 5 دقیقه آن را در 500g سانتریفوژ نموده و این کار را یکبار دیگر تکرار کنید. در نهایت رسوب را در مقداری از DPBS حل کنید به نحوی که غلظت اسپرم‌ها حدوداً 50×106 در هر میلی‌لیتر گردد.

آزمایشات متفرقه اسپرم

2-3-2-3 تهیه گسترش از اسپرم‌ها:
از سوسپانسیون بدست آمده دو لام تهیه کرده و صبر می‌کنیم تا در مجاورت هوا خشک شوند. لام‌ها را 10 دقیقه در استن یا 90 ثانیه در مخلوط استن- اتانول- فرمالدئید قرار می‌دهیم تا فیکس شوند. سپس دو بار با TBS شستشو داده و صبر می‌کنیم تا خشک شوند. لام‌ها را می‌توان در این مرحله رنگ‌آمیزی نمود و یا در آلومینیوم فویل پیچیده و در70°C- نگهداری کرد.

3-3-2-3 انکوباسیون با آنتی‌بادی‌ها:
الف- بر روی لام، منطقه‌‌ای به قطر 1cm را با grease pencil علامت‌گذاری کرده و آن را با 10µl از آنتی‌بادی مونوکلونال (آنتی‌بادی اول) می‌پوشانیم .
ب- لام‌ها را 30 دقیقه به طور افقی در یک محفظه مرطوب (مثلاً ظرف پتری حاوی کاغذ صافی مرطوب) قرار می‌دهیم تا خشک نشوند. سپس آنها را دو بار با TBS شسته و صبر می‌‌کنیم تا خشک شوند.
ج- منطقه علامت‌گذاری شده را با 10µL آنتی- آنتی‌بادی (آنتی بادی دوم) پوشانده و 30 دقیقه در محفظه مرطوب قرار می‌دهیم، سپس لام‌ها را دو بار با TBS شسته و صبر می‌کنیم تا خشک شوند.
د- به منطقه علامت‌گذاری شده، 10µL از APAAP می‌افزاییم.
ه- لام‌ها را یک ساعت در دمای اتاق و در محفظه مرطوب قرار می‌دهیم.
و- مجدداً لام‌ها را دو بار با TBS شسته و صبر می‌کنیم تا خشک شوند.
ز- مقدار 10µL سوبسترای نفتول فسفات روی لام ریخته و 20 دقیقه در دمای اتاق و محیط مرطوب قرار می‌دهیم.

4-3-2-3 رنگ‌آمیزی مخالف:
تا این مرحله لام‌ها به رنگ قرمز درآمده‌اند. آنها را با TBS شسته و چند ثانیه با هماتوکسیلین رنگ می‌کنیم و سپس با آب شیر شسته و مانته می‌کنیم.
5-3-2-3 ارزیابی سلول‌های CD45:
لام‌ها را با بزرگنمایی 200 یا 400 بررسی کنید. سلول‌های CD45 مثبت قرمز رنگ می‌باشند (شکل 1-3).
200 اسپرم را شمرده و تعداد سلول‌های CD45 مثبت را در طول این شمارش، یادداشت کنید. این شمارش را با یک لام دیگر از همان نمونه نیز انجام دهید. تفاوت سلول‌های CD45 مثبت در دو لام را به دست آورید و با استفاده از جدول (5-2) اختلاف قابل قبول را محاسبه کنید. اگر اختلاف دو شمارش در محدوده قابل قبول بود غلظت سلول‌های CD45 مثبت را حساب کنید و در غیر اینصورت آزمایش را تکرار کنید.
6-3-2-3 محاسبه غلظت سلول‌های CD45 مثبت در مایع منی:
اگر N تعداد سلول‌های CD45 مثبت در بررسی 400 اسپرم و S غلظت اسپرم‌ها باشد (106/ml) باشد، غلظت سلول‌های CD45 مثبت (C) از فرمول زیر بدست می‌آید:
 )
 
شکل (1-3) لکوسیت‌های  CD45مثبت که به رنگ قرمز درآمده‌اند.
7-3-2-3 حساسیت روش:
 اگر تعداد سلول‌های CD45 مثبت کمتر از 400 باشد میزان خطای ناشی از برداشتن نمونه از 5% فراتر می‌رود. در این موارد میزان خطا را با استفاده از جدول (2-2) گزارش نمایید. اگر کمتر از 25 سلول CD45 مثبت شمارش شود، ضمن گزارش تعداد این سلول‌ها عبارت زیر را در جواب بیمار قید می‌کنیم:
« تعداد سلول‌‌ها کمتر از حدی است که بتوان غلظت دقیق آنها را محاسبه نمود.»

مثال‌‌های عملی:
مثال یک: در شمارش 200 اسپرم، 20 سلول CD45 مثبت و در شمارش 200 اسپرم دیگر 40 سلول CD45 مثبت شمارش شده‌‌اند. مجموع دو شمارش 60 و اختلاف 20 است. با توجه به جدول )5-2( این اختلاف بیش از حد قابل قبول است و لذا آزمایش را باید تکرار نمود.
مثال دوم: در دو بار شمارش 200تایی اسپرم‌ها، به ترتیب 35 و 25 سلول CD45 مثبت مشاهده شده است. مجموع دو شمارش 60 و اختلاف آنها 10 است. با توجه به جدول (5-2) مشاهده می‌کنیم که این اختلاف در حد قابل‌ قبول است. در صورتی که غلظت اسپرماتوزوئیدهای این فرد70×106/ml  باشد، غلظت سلول‌های CD45 مثبت از رابطه زیر بدست می‌آید:
C= 70×106×( 10/5×106
چون تعداد سلول‌های CD45 مثبت کمتر از 400 است لذا میزان خطا را با توجه به جدول گزارش می‌کنیم که تقریباً 13% است.
9-3-2-3 مقادیر مرجع:
در حال حاضر هیچ حد مرجعی برای تعداد سلول‌های CD45  مثبت در مردان سالم وجود ندارد. باید توجه نمایید که اگر تعداد سلول‌های پراکسیداز مثبت فردی مثلاً1×106/ml باشد تعداد کل لکوسیت‌ها بیش از این مقدار است زیرا همه لکوسیت‌ها، پراکسیداز مثبت نیستند.
نکته: تعداد کل لکوسیت‌ها مایع منی می‌تواند نشانگر شدت یک التهاب باشد و از حاصل‌ضرب غلظت آنها در حجم مایع منی بدست می‌آید.