و تمام اسپرم‌های یک شان را بررسی می‌کنیم. حداقل 200 اسپرم را ارزیابی کرده و تعداد اسپرم‌های طبیعی و غیرطبیعی را یادداشت می‌کنیم. برای اطمینان از صحت نتایج، 200 اسپرم دیگر را به همین روش ارزیابی کرده و نتایج را مقایسه می‌کنیم. بهتر است بررسی دوم روی یک لام دیگر از همین نمونه انجام شود اما در صورتی که امکان آن نیست می‌توان هر دو شــــمارش را روی یک لام انجام داد. با توجه به جدول (1-2) در صورتی که تفاوت دو شمارش در حد قابل‌قبول بود میانگین نتایج را گزارش می‌کنیم و اگر بیش از حد مجاز بود آن را تکرار می‌کنیم.
2-17-2 مثال‌های عملی:
مثال1) در دو شمارش 200تایی، درصد اسپرم‌های نرمال به ترتیب 18 و 9 (میانگین گرد شده 14 درصد) و اختلاف آنها 9درصد می‌باشد. با توجه به جدول )1-2( برای میانگین 14درصد، اختلاف تا 7درصد قابل‌قبول است لذا این ارزیابی خارج از حد مجاز بوده و باید تکرار شود.
مثال2) در دو شمارش 200تایی، درصد اسپرم‌های نرمال به ترتیب 10 و14 (میانگین 12درصد) و اختلاف آنها 4درصد می‌باشد. با توجه به جدول )1-2 (برای میانگین 12درصد، اختلاف تا 7درصد مجاز است لذا این ارزیابی در محدوده قابل‌قبول بوده و جواب 12درصد برای بیمار گزارش می‌شود.
3-17-2 مقادیر مرجع: کمترین حد مرجع برای اسپرم‌های نرمال 4% می‌باشد.
4-17-2 ارزیابی مورفولوژی اسپرم‌های غیرطبیعی:
تفکیک شکل‌های غیرطبیعی اسپرم می‌تواند ارزش تشخیصی یا تحقیقاتی داشته باشد. برای این کار درصد اسپرم‌هایی که اختلال سر ((%H، قطعه میانی ((%M، قطعه اصلی %P)) و یا سیتوپلاسم اضافی (%C)دارند را به تفکیک گزارش می‌کنیم (به کمک یک کانتر). برای بررسی مورفولوژی 200 اسپرم را در نظر می‌گیریم.
مثال: در شمارش 200 اسپرم، 42 مورد (%21) نرمال و 158 مورد (%79) غیرطبیعی بوده است. در این میان 140 مورد اختلال سر، 102 مورد اختلال در قطعه میانی، 30 مورد اختلال در قطعه اصلی و 44 مورد افزایش سیتوپلاسم دیده شده است. در شمارش 200 اسپرم دیگر، 36 اسپرم (%18) نرمال و 164 مورد (%82) غیرطبیعی بوده است. در این میان 22 مورد اختلال سر، 108 مورد اختلال در قطعه میانی، 22 مورد اختلال در قطعه اصلی و 36 مورد افزایش سیتوپلاسم دیده شده است.
برای ارزیابی صحت کار فقط اسپرم‌های نرمال را مقایسه می‌کنیم. میانگین آنها %19.5 و اختلاف حاصل %3 است. از جدول )1-2( مشاهده می‌شود که برای میانگین %20، اختلاف تا %8 قابل‌قبول است، لذا آزمایش به طور صحیح انجام شده و نتایج به صورت زیر گزارش می‌شود:
اسپرم‌های نرمال              20%  =
اختلال سر                     66% =
اختلال قطعه میانی           53% =  
اختلال قطعه انتهایی         13% =
سیتوپلاسم اضافی            20% =
همانطور که می‌بینیم مجموع این اعداد %100 نمی‌باشد زیرا یک اسپرم ممکن است در چند ناحیه دچار اختلال باشد و چند بار شمارش شود.
گاهی اوقات در طی فرآیند اسپرم‌سازی، اسپرم‌های بدون سر به نام pin head (سرسوزنی) تشکیل می‌شود که فاقد کروماتین و عناصر سازنده سر هستند و اصولاً به عنوان اسپرماتوزوئید طبقه‌بندی نمی‌شوند. گاهی نیز ناحیه اکروزوم در اسپرم تکامل نیافته و اسپرم‌هایی با سرهای کوچک گرد یا globozoospermia تشکیل می‌شود. مردانی که تمام اسپرم‌هایشان دچار یکی از اختلالات فوق باشد معمولاً غیربارور محسوب می‌شوند، لذا در صورتی که چنین مواردی دیده شد باید جداگانه در نتیجه آزمایش بیمار گزارش شود.
18-2 ارزیابی گلبول‌های سفید در مایع منی:
در بسیاری از موارد گلبول‌های سفید که عمدتاً PMN (نوتروفیل) هستند در مایع منی دیده می‌شوند. با رنگ‌آمیزی پاپانیکولا می‌توان آنها را از اسپرماتوزوئیدها تفکیک نمود اما گاهی ممکن است با اسپرماتیدهای چند هسته‌ای اشتباه شوند، البته نوتروفیل‌ها در این رنگ‌آمیزی بیشتر رنگ آبی را به خود می‌گیرند در حالی که اسپرماتیدها بیشتر صورتی رنگ می‌شوند. (شکل 14)
 

 
قسمت بالا و شماره صفحه حذف شود و شرح جدول زيرنويس شود

روش‌های دیگری نیز برای شناسایی گلبول‌های سفید در مایع منی وجود دارد. یکی از آنها رنگ‌آمیزی پراکسیداز است که بر اساس آنزیم پراکسیداز موجود در گلبول‌های سفید، آنها را شناسایی می‌کند. با استفاده از روش‌های ایمونوشیمیایی نیز می‌توان این سلول‌ها را تفکیک نمود. در این روش‌ها آنتی‌ژن‌های اسپرم و گلبول‌های سفید هدف رنگ‌آمیزی هستند.
1-18-2 رنگ‌آمیزی پراکسیداز با استفاده از ارتوتولوئیدین:
این روش ساده و ارزان است و می‌تواند به تفکیک گرانولوسیت‌ها کمک کند.
1-1-18-2 اصول روش:
 اساس این روش شناسایی گرانولوسیت‌ها بر اساس فعالیت آنزیم پراکسیداز آنها است. در این روش گلبول‌های سفید پلی مورفونوکلئر که پراکسیداز مثبت هستند از اسپرماتیدهای چند هسته‌ای که پراکسیداز منفی هستند تفکیک می‌شوند اما در دو مورد زیر گلبول‌های سفید شناسایی نمی‌شوند:
الف- نوتروفیل‌های فعال شده که گرانول‌های خود را رها کرده‌اند.
ب- سایر گلبول‌های سفید مثل لنفوسیت‌ها، ماکروفاژها و مونوسیت‌ها که فاقد پراکسیداز هستند.
2-1-18-2 معرف‌ها:
1.    بافر فسفاتmmoL/L67 با 6PH=: مقدار 9.47 گرم سدیم هیدروژن فسفات (Na2HPo4) را درmL1000 آب مقطر حل نمایید. g9.8 پتاسیم دی هیدروژن فسفات (KH2Po4) را نیز در mL1000 آب مقطر حل کنید. این دو محلول را به گونه‌ای به هم بیفزایید تا PH برابر 6 شود [تقریباً mL12 از محلول Na2HPo4 با mL88 از KH2Po4]
2.    محلول اشباع کلریدآمونیوم (NH4CL): مقدار25Og از NH4CL را به mL1000 آب مقطر اضافه کنید.
3.    محلول دی سدیم اتیلن دی آمین تترا استیک اسید (Na2EDTA) mmoL/L148: مقدار g50 از Na2EDTA را در یک لیتر بافر فسفات با PH 6 (که در مرحله یک تهیه کرده‌اید) حل کنید.
4.    سوبسترا: مقدار mg2.5 از ارتوتولوئیدین را در mL10 از سالین %99g/L)) حل کنید.
5.    هیدروژن پراکسید (H2o2)%30
6.    محلول کار: به mL9 از سوبسترای ارتوتولوئیدین، mL1 محلول اشباع NH4CL، ml1 محلول Na2EDTA mmoL/L148 و µL10 ازH2o2%30  اضافه نموده و مخلوط کنید. این محلول را تا 24 ساعت پس از ساخت می‌توانید استفاده کنید.
توجه: از آنجا که ارتوتولوئیدین به عنوان یک کارسینوژن شناخته شده است، هنگام کار با آن باید اقدامات ایمنی را لحاظ کرد.
3-1-18-2 روش کار:
1.    نمونه مایع منی را به خوبی مخلوط کنید
2.    mL0.1 از نمونه را با mL0.9 از محلول کار مخلوط کنید
3.    به مدت 10 ثانیه آن را با ورتکس مخلوط کرده و 30-20 دقیقه در حرارت اتاق قرار دهید
4.    به روش ذکر شده یک نمونه دیگر نیز تهیه کنید. بدین ترتیب دو نمونه رنگ‌آمیزی شده از مایع منی بیمار تهیه کرده‌ایم.
4-1-18-2 ارزیابی سلول‌های پراکسیداز مثبت در لام نئوبار
1.    پس از 30-20 دقیقه، سوسپانسیون‌های فوق را به خوبی مخلوط کنید و هر طرف لام نئوبار را با یکی از آنها پر کنید.
2.    لام را 4 دقیقه به طور افقی در حرارت اتاق و در یک محیط مرطوب قرار دهید (مثلاً در یک ظرف پتری که در آن کاغذ صافی مرطوبی قرار دارد)
3.    لام را با میکروسکوپ فازکنتراست و بزرگنمایی 200 یا 400 بررسی کنید
4.    سلول‌های پراکسیداز مثبت، قهوه‌ای رنگ شده در حالیکه سلول‌های پراکسیداز منفی بی‌رنگ می‌مانند. در هر طرف لام حداقل 200 سلول پراکسیداز مثبت را شمارش نمایید و تعداد مربع‌هایی که این 200 سلول را در آن‌ها شمرده‌اید، یادداشت کنید. توجه کنید که مربع‌ها باید به طور کامل شمارش شوند و اگر در میان شمارش یک مربع به عدد 200 رسیدید شمارش را ادامه داده تا تمام سلول‌های پراکسیداز مثبت شمرده شوند.
5.    شمارش را در طرف دیگر لام نئوبار نیز ادامه داده و تعداد مربع‌ها را یادداشت کنید.
6.    مجموع دو شمارش و اختلاف آنها را حساب کنید و از جدول (5-2) صحت کار را بررسی نمایید. اگر اختلاف در محدوده قابل‌قبول بود، غلظت این سلول‌ها را محاسبه کرده و گزارش نمایید و در غیر این‌صورت آزمایش را مجدداً تکرار کنید.
 
5-1-18-2 روش محاسبه غلظت سلول‌های پراکسیداز مثبت در مایع منی:
برای رقت   (9+1) غلظت سلول‌های پراکسیداز مثبت از رابطه زیر به دست می‌آید:
C=  × ×10 = ×
که در آن:
C = غلظت سلول‌های پراکسیداز مثبت در نانولیتر
N = تعداد سلول‌های پراکسیداز مثبت
n = حجم کل مربع‌هایی که شمارش در آنها انجام شده است (حجم هر مربع 100 نانولیتر است)
نکته: از این معادله می‌توان تعداد سلول‌های گرد (round cells) را نیز محاسبه نمود. برای این کار تمام سلول‌های پراکسیداز مثبت و منفی را شمرده و به جای N قرار می‌دهیم.
6-1-18-2 حساسیت روش:
در صورتی که کمتر از 400 سلول پراکسیداز مثبت در دو طرف لام نئــــوبار دیده شد با توجه به جدول )2-2( میزان خطا را گزارش کنید. اگر کمتر از 25 سلول پراکسیداز مثبت در هر طرف لام نئوبار باشد غلظت آنها کمتر از 277000 سلول در میلی‌لیتر است و خطای حاصل برابر %20 است. دراین حالت گزارش آزمایش بیمار به صورت زیر ارائه می‌شود:
 « تعداد سلول‌ها کمتر از حدی است که بتوان غلظت دقیق آنها را تعیین نمود (<277000/mL) »
نکته: نبودن سلول‌های پراکسیداز مثبت در بخشی از نمونه که برای آزمایش برمی‌داریم دلیلی بر وجود نداشتن آنها در کل نمونه نیست.
7-1-18-2 مثال‌های عملی:
مثال اول: نمونه‌ای   رقیق شده است. در یک طرف لام نئوبار 60 سلول پراکسیداز مثبت را در 9 مربع شمرده‌ایم و در طرف دیگر 90 سلول را در همین فضا شمارش کرده‌ایم. مجموع دو شمارش 150 سلول (در 18 مربع) و تفاوت آنها 30 می‌باشد. با توجه به جدول (5-2) این عدد بیش از خطای مجاز است و باید آزمایش را تکرار کرد.
مثال دوم: نمونه‌ای   رقیق شده است. در یک طرف لام نئوبار 204 سلول پراکسیداز مثبت را در 5 مربع شمرده‌ایم و در طرف دیگر 198 سلول را در همین فضا شمارش کرده‌ایم. مجموع دو شمارش 402 سلول (در10 مربع) و تفاوت آنها 6 می‌باشد. با توجه به جدول (5-2) این عدد در محدوده خطای مجاز است و لذا غلظت سلول‌های پراکسیداز مثبت را بصورت زیر محاسبه می‌کنیم:
C =  ×  →    C =  ×  = 4.02/nL یا4 × 106 /mL
مثال سوم: نمونه‌ای   رقیق شده است. در یک طرف لام نئوبار 144 سلول را در 9 مربع شمرده‌ایم و در طرف دیگر 162 سلول را در همین فضا شمارش کرده‌ایم. مجموع دو شمارش 306 سلول [در 18 مربع] و تفاوت آنها 18 می‌باشد. با توجه به جدول (5-2) این عدد در محدوده خطای مجاز است و لذا غلظت سلول‌های پراکسیداز مثبت را محاسبه می‌کنیم:
C =  ×  =1 /7 /nL یا    1/7 × 106 /mL
چون تعداد سلول‌های شمارش شده در کل لام نئوبار کمتر از 400 است میزان خطا را با استفاده از جدول 2-2 گزارش می‌کنیم که تقریباً %6 است.
مثال چهارم: نمونه‌ای   رقیق شده است. هیچ سلول پراکسیداز مثبتی در کل لام دیده نمی‌شود. چون کمتر از 25 سلول در 9 مربع وجود دارد، غلظت سلول‌هایPMN کمتر از 277000 سلول در میلی‌لیتر است و نتیجه به صورت زیر گزارش می‌شود:
«سلول پراکسیداز مثبت دیده نشد و نمی‌توان شمارش دقیقی از غلظت این سلول‌ها ارائه نمود (کمتر از (277000/mL»
8-1-18-2 مقادیر مرجع:
مقادیر مختلفی در این زمینه ارائه شده که بین O.5 × 106 تا 1 × 106 متفاوت است. در این کتاب عدد 1 × 106/mLبه عنوان مقدار مرجع اعلام می‌شود.
نکته:
الف- تعداد کل سلول‌های پراکسیداز مثبت در مایع منی می‌تواند نشانگر شدت ضایعه التهابی باشد و از حاصل‌ضرب غلظت سلول‌های پراکسیداز مثبت در حجم مایع منی به دست می‌آید.
ب- افزایش گلبول‌های سفید مایع منی (Leukocytospermia یا Pyospermia) می‌تواند ناشی از عفونت باشد.
ج- افزایش گلبول‌های سفید در مایع منی می‌تواند با ایجاد یک فرآیند اکسیداتیو باعث ایجاد آسیب در حرکت اسپرم و انسجام DNA آن گردد. این تخریب به عوامل زیر بستگی دارد:
(a طول زمان تماس گلبول‌های سفید با اسپرم‌ها
 (bنوع گلبول‌های سفید
(c فعال یا غیر فعال بودن گلبول‌های سفید در محل

19-2 ارزیابی سلول‌های زایا (Germ cells) در مایع منی:
سلول‌های زایا شامل اسپرماتیدها، اسپرماتوسیت‌ها و ندرتاً سلول‌های اسپرماتوگونی می‌باشند. این سلول‌ها را می‌توان در لام رنگ‌آمیزی شده شناسایی کرد اما زمانی که سلول‌ها در حال دژنراسیون هستند تشخیص آنها از سلول‌های التهابی مشکل خواهد بود.
معمولاً اسپرماتیدها و اسپرماتوسیت‌ها را در لام‌هایی که به روش پاپانیکولا رنگ‌آمیزی شده‌اند می‌توان از گلبول‌های سفید تفکیک کرد. تفکیک این سلول‌ها ممکن است به روش‌های دیگری نیز صورت گیرد که اساس آنها می‌تواند بر مبنای اندازه و شکل هسته، عدم وجود آنزیم پراکسیداز (در بخش )18-2 (شرح داده شد) و یا فقدان آنتي‌ژن‌های اختصاصی لکوسیتی (بخش2-3) باشد.
اسپرماتیدهای چند هسته‌ای ممکن است از نظر مورفولوژی با سلول‌های PMN اشتباه شوند. البته در رنگ‌آمیزی، این سلو‌ل‌ها صورتی رنگ می‌شوند؛ در حالی که سلول‌های PMN آبی رنگ می‌شوند. اندازه هسته نیز می‌تواند به تفکیک این سلول‌ها از هم کمک کند. سلول‌های اسپرماتوگونی (که به ندرت در مایع منی دیده می‌شوند) هسته‌ای به اندازه تقریبی 8µm دارند، هسته اسپرماتوسیت‌ها حدود 10µm و اسپرماتیدها 5µm است. این ابعاد فقط کمک‌کننده هستند زیرا دژنراسیون و تقسیمات هسته‌ای بر اندازه آنها اثر می‌گذارد.